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Doc'J : Association des jeunes chercheurs de Jouy-en-Josas

Zone de texte éditable et éditée

Résumés des présentations orales du colloque 2009

Transduction de signaux chez les procaryotes par les systèmes à 2 composants

Benoit Thevenard (benoit.thevenard@jouy.inra.fr)

INRA, Unité BIOBAC, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy en Josas Cedex, France

Présentation générale des systèmes à deux composants (TCS chez les procaryotes): principe de fonctionnement, classification, structure et domaines conservés, 3 ou 4 exemples de fonctions régulées par les TCS et enfin en conclusion une ouverture sur l'intérêt de l'étude des TCS chez S. thermophilus (mon sujet de thèse). (Premiers résultats sur poster).

Implication du microbiote intestinal dans les pathologies hépatiques liées au surpoids

Tiphaine Le Roy (tiphaine.leroy@jouy.inra.fr)

Unité d'Ecologie et de Physiologie du Système Digestif, INRA, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy en Josas cedex, France

.Encadrant : Philippe Gérard

Les maladies hépatiques liées à l'obésité constituent un important problème de santé publique dans les pays industrialisés. En France, ces maladies sont responsables de la mort d'environ 100 000 personnes par an. Ces maladies, regroupées sous le nom de Non-alcoholic Fatty Liver Disease, commencent par une phase de stéatose, c'est-à-dire une accumulation de triglycérides dans les hépatocytes. Ce stade de la maladie, qui touche plus de 90% des obèses, est relativement bénin et peut perdurer des années voire des dizaines d'années. Dans 20% des cas, il survient ensuite une stéatohépatite, c'est-à-dire une inflammation du foie qui évolue fréquemment vers une cirrhose et éventuellement un cancer. Les facteurs déclenchants de cette inflammation sont mal connus et ne dépendent pas du degré d'obésité. Toutefois, il est maintenant reconnu que le microbiote intestinal (l'ensemble des bactéries peuplant notre système digestif joue un rôle, non encore défini, dans l'initiation de cette inflammation.

Le microbiote intestinal étant spécifique de chaque individu, notre hypothèse de travail est que cette variabilité du microbiote explique le fait que seulement certains individus développent une stéatohépatite. Les objectifs de ce projet sont d'identifier les populations bactériennes impliquées dans l'apparition de l'inflammation hépatique et de caractériser les mécanismes en jeux. Pour cela, la stratégie envisagée comporte deux phases distinctes, une première sur souris conventionelles (hébergeant leur microbiote d'origine) et une phase sur souris à microbiote contrôlé.

Lors de la première phase, des souris recevront un régime hyperlipidique durant 4 mois. La composition de leur microbiote intestinal sera alors analysée ainsi que différents paramètres permettant d'évaluer leur inflammation hépatique. Ceci permettra d'établir une corrélation entre cette composition et le niveau d'atteinte hépatique. Nous sélectionnerons alors des microbiotes associés à des niveaux d'inflammation bas ou élevés. La seconde phase sera réalisée en enceintes stériles (isolateurs) où nous disposons de souris dépourvues de microbiote intestinal. Nous implanterons chez ces souris les microbiotes sélectionnés précédemment, ce qui permettra d'obtenir des groupes de souris au microbiote identique. Ces souris seront soumises au même régime afin de déterminer si les microbiotes sélectionnés peuvent avoir un effet protecteur ou déclencheur d'une inflammation hépatique.

Les résultats attendus permettront d'envisager, via l'analyse et la modulation du microbiote intestinal, une prédiction, un diagnostique et un traitement de ces pathologies.

Mots clés : microbiote intestinal, obésité, pathologies hépatiques, inflammation, souris conventionelles, souris à microbiote contrôlé.

(hébergeant leur microbiote d'origine) et une phase sur souris à microbiote contrôlé.

L'administration intragastrique d'une souche anti-inflammatoire de Lactobacillus casei produisant une superoxyde dismutase atténue la sévérité de la colite au DSS chez la souris

Laurie Watterlot (laurie.watterlot@jouy.inra.fr)

Unité d'Ecologie et de Physiologie du Système Digestif, INRA, Domaine de Vilvert, 78352 Jouy en Josas cedex, France

Laurie Watterlot, T. Rochat, C Cherbuy, I. Bouloufa, JJ. Gratadoux, S. Blugeon, S. Chilmonczyk, E Honvo-Houeto, G. Corthier, H. Sokol, P. Langella et L.G. Bermúdez-Humarán*

Le stress oxydant est impliqué dans la pathogénie des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Il se caractérise par une formation excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui sont hautement instables et peuvent agresser de nombreux constituants cellulaires. L'objectif de notre travail est d'évaluer l'apport par la souche Lactobacillus casei BL23 (BL23) d'une enzyme majeure de détoxification des ROS, la superoxyde dismutase (SOD) dans un modèle murin de colite. Nous avons précédemment exprimé avec succès la catalase MnKat de Lb. plantarum chez BL23 et avons testé BL23 productrice ou non de MnKat dans un modèle murin d'inflammation intestinale modérée induite au Dextran Sodium Sulfate (DSS 1%). Nous avons ainsi démontré que BL23 avait un effet anti-inflammatoire et que la catalase n'augmentait pas cet effet (Rochat et al, 2007). Afin de reconstituer la chaîne de détoxication des ROS, nous avons cloné la SOD de Lactococcus lactis MG1363 chez BL23 (BL23 SOD+). Nous avons d'abord démontré que Lb. casei BL23 SOD+ réduisait le stress oxydant sur une lignée de macrophages en culture. Afin d'évaluer le rôle protecteur de la SOD, nous avons ensuite analysé les effets de BL23 SOD+, de BL23 MnKat+ et de la co-administration des 2 souches recombinantes en modèle d'inflammation sévère au DSS (DSS 3%). Seule l'administration de la souche BL23 SOD+ (seule ou en association avec la souche BL23 MnKat+) induisait une diminution significative de l'inflammation sur les scores cliniques et histologiques de colite. Nous avons donc montré que i) BL23 SOD+ atténue la sévérité de la colite au DSS 3% alors que ii) BL 23 productrice ou non de MnKat n'a pas d'effet dans ce modèle (Watterlot et al, en préparation). Nos perspectives sont de tester i) l'effet de ces souches SOD+ dans d'autres modèles inflammatoires associés à un stress oxydant ; ii) la co-administration in vivo de ces souches SOD+ avec des souches de lactobacilles délivrant des cytokines anti-inflammatoires et ii) l'utilisation de vecteurs bifidobactéries pour délivrer la SOD. Ces approches innovantes pourraient ouvrir de nouveaux horizons thérapeutiques dans les MICI.

Références :

1. Rochat T, Bermúdez-Humarán L, Gratadoux JJ, Fourage C, Hoebler C, Corthier G, and Langella P. 2007. Anti-inflammatory effects of Lactobacillus casei BL23 producing or not a manganese-dependant catalase on DSS-induced colitis in mice. Microb Cell Fact. 6:22.

2. Watterlot, L., T. Rochat, C Cherbuy, I. Bouloufa, JJ. Gratadoux, S. Blugeon, S. Chilmonczyk, E Honvo-Houeto, G. Corthier, H. Sokol, P. Langella and L.G. Bermúdez-Humarán. Improvement of a DSS-induced colitis in mice using one anti-inflammatory Lactobacillus casei strain expressing a manganese superoxide dismutase. En préparation.

Modulation de la voie NF-?B par les différentes souches commensales de streptocoques buccaux du groupe salivarius.

Ghalia Kaci (ghalia.kaci@jouy.inra.fr)

Ghalia Kaci1, Omar Lakhdari2, Joël Doré2, S. Dusko Ehrlich1, Pierre Renault1, Hervé Blottière2et Christine Delorme1.

1) Laboratoire de Génétique Microbienne, Institut National de Recherche Agronomique,78352 Jouy-en-Josas Cedex, France.

2) UEPSD, Institut National de Recherche Agronomique,78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

Les streptocoques du groupe salivarius sont phylogénétiquement proches mais forment un groupe hétérogène dû à leurs niches écologiques différentes. S. thermophilus est une espèce largement utilisée dans l'alimentation, alors que S. salivarius et S. vestibularis sont des bactéries commensales du microbiote buccal. L'un des rôles important des bactéries commensales est le maintien de l'homéostasie épithéliale avec notamment un rôle modulateur du système immunitaire permettant ce que l'on appelle « la tolérance orale ». La voie de signalisation NF-?B est un des éléments clef de la réponse immunitaire et inflammatoire qui est activée par de nombreux stimuli pro-inflammatoires. L'inhibition de la voie de signalisation NF-?B constitue une des pistes de recherche majeure dans le domaine de la pharmacomodulation de l'inflammation. Une identification des molécules inhibitrices de cette voie peut ouvrir de nouveaux horizons en vue de traitements plus efficaces des maladies inflammatoires. Nous avons évalué le rôle potentiel modulateur de l'inflammation de S. salivarius dans un modèle de cellules épithéliales humaines. Le modèle cellulaire est une lignée de cellules tumorales humaines de morphologie épithéliales (HT29-clE) transfectées de manière stable avec un gène rapporteur à la luciférase de l'activation de la voie NF-?B. Nous avons tout d'abord testé l'effet de 41 souches de S. salivarius et S. vestibularis sur la voie NF-?B activée par une cytokine pro-inflammatoire. Les surnageants de cultures abolissent l'activation de la voie NF-?B et en fonction des souches un potentiel inhibiteur de 30% à 70% est observé. Nous avons montré que l'effet inhibiteur des surnageants de culture est indépendant de l'acide lactique et des pH acides. Le produit actif sur la voie NF-?B est sécrété et accumulé pendant la croissance bactérienne. Nous avons également montré que le produit inhibiteur est d'une taille moléculaire inférieur à 3kDa et sa nature reste à être identifiée.

Mots clés : S.salivarius, S.vestibularis, dialogue bactéries commensales/hôte, voie de signalisation NF-?B.

Effet du microbiote sur la maturation de l'épithélium colique

Laura Wrzosek (laura.wrzosek@jouy.inra.fr)

UEPSD, Institut National de Recherche Agronomique, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

Le tractus digestif abrite un microbiote en interaction permanente avec l'hôte. Chez des animaux dépourvus de microbiote (axéniques) le taux de renouvellement des cellules épithéliales ainsi que le cycle cellulaire sont ralentis.

L'épithélium colique est une structure dynamique en constant renouvellement dont l'unité architecturale est la crypte. Les cryptes se composent dans leur partie inférieure d'un compartiment prolifératif et dans leur partie supérieure d'un compartiment de différenciation. Au fond des cryptes se trouvent les cellules souches qui prolifèrent et acquièrent un phénotype différencié au fur et à mesure de leur migration le long de la crypte.

Nous avons observé que l'implantation d'un microbiote complexe chez des rats axéniques induit une augmentation de 30% de la profondeur des cryptes. Cette augmentation nécessite une activation très orchestrée des protéines impliquées dans le cycle cellulaire. Cette réponse de l'hôte suite à l'arrivée d'un microbiote complexe se déroule en deux phases :

- une phase précoce d'hyperprolifération à 2 jours d'implantation d'un microbiote complexe avec l'augmentation de protéines impliquées dans la prolifération (PCNA, Ki67) ;

- une phase tardive d'arrêt de prolifération à 14 jours d'implantation d'un microbiote complexe avec l'augmentation de protéines impliquées dans l'inhibition du cycle cellulaire (p21, p27).

L'objectif de mon stage (dans le cadre d'un M2) est d'une part de préciser la durée de ces deux phases à l'aide de rats porteurs d'un microbiote complexe pendant 4 heures, 1 jour et 7 jours ; et d'autre part d'étudier le phénotype des cellules composant la crypte en comparant la proportion des types cellulaires différenciés (colonocytes, cellules à mucus et cellules entéro-endocrines) en fonction du statut bactérien.

Mots clés : côlon - microbiote intestinal - cycle cellulaire

Molecular mechanisms of odorant detection: oligomerization of the olfactory receptors

Fallou Wade (fallou.wade@jouy.inra.fr)

Unité NOPA, Institut National de Recherche Agronomique,78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

The olfactory system allows the animals to detect, discriminate, and recognize a large number of odorants. The dynamic interaction between olfactory receptors (OR), OBPs and the odorants, constitutes the first step of odorant detection.

The ORs belong to the super family of seven transmembrane domains, G Protein Coupled Receptors (GPCRs), many of which are already documented to undergo oligomerization, either during their trafficking to the plasmic membrane, or upon ligand stimulation.

Identification of the oligomerization state of ORs is necessary to further investigate the molecular mechanisms of OR-ligand interactions and the initiation of olfactory signal transduction.

Several strategies will be used to monitor the oligomerization state of ORs. 1) The FRET technique (Förster Resonance Energy Transfer) will use fluorescent protein (CFP or YFP)-tagged receptors to estimate the proximity and adequate orientation of a donor OR relative to an acceptor OR. A special care will be taken to avoid ORs overexpression which would result in artefactual effects due to receptors promiscuity. 2) In order to reach more sensitive and precise measurements of the FRET, the FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) technique will be used. 3) Co-immunoprecipitation of differentially tagged ORs will be performed. 4) Dominant negative peptides, corresponding to ORs domains suspected to be involved in dimerization will be co-expressed with ORs to interfere with oligomerization. This may result either in a decreased membrane expression level, and/or in an attenuated functional response.

Modulation des cartes d'activation glomérulaire par le statut nutritionnel dans le bulbe olfactif de rat : quel rôle pour les astrocytes ?

Mounir Bendahmane (mounir.bendahmane@jouy.inra.fr)

Unité NOPA, Institut National de Recherche Agronomique,78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

La prise alimentaire est fortement liée à la perception olfactive : une odeur n'est pas perçue de la même manière selon qu'un animal soit affamé ou rassasié ; la quantité ingérée d'un aliment dépend notamment de son odeur. De plus, des molécules impliquées dans le contrôle de la prise alimentaire comme l'insuline, la leptine ou l'orexine modulent la perception olfactive et l'activité neuronale du système olfactif. Cette modulation passe par une action sur les neurones, et potentiellement par une action sur les astrocytes.

Dans cette étude, nous nous intéresserons aux effets du statut nutritionnel sur l'activité du bulbe olfactif (BO), première structure centrale reliant l'information olfactive. Par des marquages c-fos, notre laboratoire a montré que l'activité neuronale dans le bulbe olfactif est modifiée par le statut nutritionnel. Dans ce contexte, nous proposons une étude en trois étapes : i) par imagerie optique, nous comparerons les cartes d'activation glomérulaire chez des rats affamés vs rassasiés. Le signal que nous enregistrons in vivo est dépendant de l'oxygénation vasculaire et il est enclenché par l'activité astrocytaire. ii) par des techniques de biologie moléculaire (RT-PCRq, Western blott) et de microscopie optique et électronique, nous étudierons les variations anatomo-fonctionnelles des astrocytes de la couche glomérulaire iii) enfin, par enregistrements électrophysiologiques in vivo, nous nous intéresserons aux couches sous-glomérulaires pour étudier l'impact du statut nutritionnel sur les oscillations pendant la présentation de l'odeur.

L'ensemble de ces résultats nous permettra de mettre en évidence le rôle des astrocytes dans les changements de la perception olfactive en fonction du statut nutritionnel.

Mots clés : nutrition, olfaction, astrocytes, plasticité, imagerie.

Les finTRIMs, un groupe de protéines TRIM très diversifiées chez les poissons: un nouvel arsenal pour les défenses antivirales ?

Lieke M van der Aa

VIM, Virologie et Immunologie Moléculaires, Institut National de Recherche Agronomique, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, France

Une démarche de criblage de transcrits induits par les rhabdovirus dans les leukocytes de truite arc-en-ciel a permis d'identifier un nouveau type de séquences de protéines TRIM. Ces protéines présentent les motifs typiques ring, BBox,et coil-coiled ainsi qu'un domaine B30.2 C-terminal. La surprenante diversité des transcrits finTRIM (pour fish novel TRIM) chez la truite - plus de 60 séquences différentes - et leur caractère inductible suggérait un rôle possible dans les défenses antivirales, auxquelles participent différents autres groupes de TRIM comme TRIM5, TRIM22, TRIM19/PML, TRIM16 et TRIM25. La diversité génomique des finTRIMs a donc été analysée, conduisant à l'identification de 84 gènes distribués en plusieurs clusters chez le poisson-zèbre. Le degré de diversification est variable selon les espèces de poissons et seuls les gènes les plus primitifs sont inclus dans des groupes de synténie conservée, ce qui indique que ces gènes se sont probablement diversifiés assez récemment. Le domaine B30.2 des finTRIMs a évolué sous une forte pression de sélection positive, et les sites diversifiés correspondent remarquablement aux régions variables du domaine B30.2 de TRIM5alpha chez les mammifères, qui déterminent la spécificité virale de ces facteurs importants des défenses contre les rétrovirus. Par ailleurs, le domaine B30.2 des finTRIMs est plus proche de celui de protéines "NOD like receptor" que de celui des autres TRIMs présents dans le génome de la même espèce. Les profils d'expression, la diversité et l'évolution des finTRIMs suggèrent donc que ces protéines pourraient jouer un rôle important dans les défenses antivirales des poissons. Leurs propriétés fonctionnelles sont en cours d'étude.

Ce travail vient d'être publié dans : BMC Biology 2009, 7:7 doi:10.1186/1741-7007-7-7

Propagation of monoglycosylated and tagged prions in cell culture

Muhammad Salamat (muhammad.salamat@jouy.inra.fr)

Salamat MKF, Moudjou M, Laude H, Dron M.

INRA, U892, Virologie Immunologie Moléculaires, 78350 Jouy-en-Josas, France

The host encoded cellular prion protein (PrPC), implicated in neurodegenerative diseases is expressed in many parts of body preferentially in central nervous system (1). PrPC can transform into an insoluble and proteinase resistant isoform called PrPSc (Sc for scrapie), the major or exclusive component of prion that accumulates preferentially in central nervous system and is responsible for well known Creutzfeldt-Jakob disease in humans as well as scrapie in sheep and bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle. Among factors that affect PrPC transformation in disease, the role played by glycosylation remains vague. Moreover, the cellular and molecular events responsible for the conversion of PrPC to PrPSc have not yet been fully elucidated.

To address the hypothesis that glycosylation of host PrP is a major factor influencing TSE infection and propagation (2), we introduced mutations which modified the glycosylation status of the molecule and analyzed clone populations expressing the mutant proteins. The ROV cells (3) expressing mutant PrPs were infected by ovine prion strain 127S (4) and tested for the accumulation of PrPSc. In a first attempt, the asparagine of the sequon NFT at position 200 was replaced by a series of amino acids to invalidate this second site of glycosylation whereas the first glycosylation site at position 184 remains intact. The PrP mutants presented only monoglycosylated and unglycosylated as compared to wild PrPC which is strongly biglycosylated. Our results demonstrate that monoglycosylated mutants bestow permission to infection and the biglycosylated form is not essential for the conversion.

To find out the cellular and molecular events underlying the conversion mechanism, indentify the cointeracting proteins and visualize live infected cells, we constructed mutant PrPs with different available tags commonly used for fluorescence and purification. In a first attempt, we tested tetracysteine tag at N-term. The cells expressing this mutant PrP were found permissible for prion infection and propagation, the two major characteristics of prion infection. We also constructed PrP with polyhistidine and Flag tags at different sites of protein sequence. The conversion potential of these mutants into prions and their use for above mentioned objectives remain to be evaluated.

1. Prusiner SB. 1998. PNAS 95(23):13363-83.

2. Tuzi et al., 2008. PLoS Biol. 6(4):e100.

3. Paquet et al., 2004. J Virol. 78(13):7148-52.

4. Paquet et al.,2007. J Virol. 81(19):10786-91.

Key words: prion protein, glycosylation, tagged-PrP, visualization,

Différences de teneurs en acides gras polyinsaturés oméga-3 entre mâles et femelles chez le rat

Audrey EXTIER (audrey.extier@jouy.inra.fr)

Extier A1, Langelier B1, Perruchot MH1, Guesnet P1, Lavialle M1, Pédrono F2, Legrand P2, Alessandri JM1

(1)Unité NuRéLiCe, INRA UR909, Jouy-en-Josas, France.

(2)Laboratoire de Biochimie-Nutrition humaine, Agrocampus, INRA USC 2012, Rennes, France

Introduction et but de l'étude

Les acides gras polyinsaturés oméga-3 ou n-3 sont des constituants majeurs des membranes cellulaires et exercent des effets bénéfiques pour la santé humaine. Le principal AGPI n-3 est l'acide docosahexaénoïque (DHA). Il peut être apporté par l'alimentation (poisson gras) ou converti à partir de son précurseur essentiel, l'acide ?-linolénique (ALA, huiles végétales), principalement au niveau hépatique. L'objectif de cette étude est de comparer le statut en DHA et l'expression d'enzymes clés de la voie de conversion entre des rats mâles et femelles soumis à deux apports alimentaires en ALA

Matériel et méthode

Des rats Wistar mâles et femelles nés déficients en AGPI n-3 sont soumis dès le sevrage (21j) à un régime couvrant ou non les besoins nutritionnels en ALA pendant 5 semaines (n=6 par groupe). A l'âge de 3 et 8 semaines, la composition en acides gras du foie et du cortex cérébral est analysée par chromatographie en phase gazeuse, l'expression des ARNm est mesurée par RT-PCR en temps réel (Low Density Array), et l'expression des protéines par western blotting.

Résultats

A 3 semaines, aucune différence n'est observée entre les mâles et les femelles. A 8 semaines, les rats femelles ont une teneur plus élevée en DHA dans les phospholipides du foie (+15 à +35%) comparativement aux mâles du même régime. Quel que soit le régime, l'expression hépatique des ARNm des ?5 et ?6 désaturases (x2 à x3) et des élongases 2 et 5 (x1,5 à 2,5) est plus élevée chez les femelles. L'expression protéique des ?5 et ?6 désaturases est également plus élevée chez les femelles (+50%). Aucune différence liée au genre n'est observée dans le cortex cérébral.

Conclusion :

Avec un régime alimentaire couvrant ou non les besoins nutritionnels en ALA, la conversion du ALA en DHA est plus élevée chez les rats femelles que chez les mâles et pourrait s'expliquer par une régulation de l'expression des désaturases et des élongases, des enzymes clés de la voie de conversion. Nos résultats sont en accord avec les données généralement obtenues chez l'humain (plus de DHA chez les femmes) et permettent d'accroître notre compréhension du métabolisme des AGPI n-3.

Etude fonctionnelle du transport de nickel et de l'uréase chez Staphylococcus aureus.

Cécile DELPORTE (cecile.delporte@jouy.inra.fr)

Institut National de la Recherche Agronomique Unité Bactéries Lactiques et pathogènes Opportunistes (UBLO) Domaine de Vilvert-78352 JOUY-EN-JOSAS, France

Le nickel est un cofacteur important pour diverses enzymes. Chez Staphylococcus aureus, bactérie pathogène majeure de l'homme et des animaux à sang chaud, seule l'uréase est nickel-dépendante. Chez cette bactérie, l'import du nickel peut être effectué par un système de transport appartenant à la famille des ABC-transporteurs, NikABCDE. Une perméase à nickel codée par le gène nixA est aussi présente.

Dans l'optique de caractériser ces transporteurs, deux études en parallèles sont menées : une étude de la régulation potentielle de leur expression à l'aide de fusions transcriptionnelles avec un gène rapporteur. Et une étude fonctionnelle de leur implication sur l'activité uréase.

Mots clés : Staphylococcus aureus ; ABC-transporteurs NikABCDE ; perméase à nickel NixA ; uréase.

Cécile DELPORTE

M2 GCDE à Orsay (PARIS 11)

Institut National de la Recherche Agronomique

Unité Bactéries Lactiques et pathogènes Opportunistes (UBLO)

Domaine de Vilvert-78352 JOUY-EN-JOSAS, France

Mécanismes moléculaires de la sécrétion des caséines dans la cellule épithéliale mammaire de souris durant la lactation

Sophie CHAT (sophie.chat@jouy.inra.fr)

Sophie CHAT, Eric CHANAT, Sandrine TRUCHET

UR1196 Génomique et Physiologie de la Lactation (GPL), INRA de Jouy-en-Josas.

La glande mammaire (GM) des mammifères est un organe complexe dont le rôle est de produire le lait après la parturition. Le lait est un mélange de minéraux, vitamines, protéines et lipides permettant l'alimentation des petits jusqu'au sevrage. La fraction protéique du lait est essentiellement constituée par les caséines qui sont synthétisées par la cellule épithéliale mammaire (CEM) en réponse à une hormone lactogène : la prolactine (PRL). Ces protéines sont transportées vers le pôle apical de la CEM où elles sont sécrétées dans la lumière des acini mammaires (exocytose). Le trafic intracellulaire et le processus d'exocytose reposent des échanges de membranes via des événements de fusion et de fission entre différents compartiments. En s'associant sous forme de complexes, les protéines SNAREs constituent la machinerie protéique minimale permettant les échanges de membrane au sein de la cellule.

Le but du projet est de caractériser les protéines SNAREs impliquées dans la formation du complexe permettant la sécrétion des caséines par la CEM de souris pendant la lactation.

Pour cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés aux SNAREs localisées à la membrane plasmique ou sur les vésicules de sécrétion. Nos résultats montrent que les ARNs codant ces protéines sont exprimés dans la GM de souris et les protéines correspondantes ont été mises en évidence dans la fraction membranaire de CEMs isolées à différents stades de différenciation. La localisation subcellulaire des SNAREs a été étudiée sur des coupes de GM à différents stades, par immunofluorescence indirecte en microscopie de fluorescence et par immunomarquage à l'or en microscopie électronique. Les protéines SNAREs formant le complexe d'exocytose des caséines sont en cours d'identification par WB et spectrométrie de masse après immunoprécipitation des complexes.

Mots clefs : trafic, SNAREs, exocytose, cellule épithéliale mammaire, lactation

Comparative proteomic analysis of microsomal proteins using 2D-DIGE: Impact of CSN1S1 (alphaS1-casein) deficiency on the endoplasmic reticulum protein profile in mammary epithelial cells

Hichem LAHOUASSA (hlahouassa@jouy.inra.fr)

Hichem Lahouassa1, Christian Beauvallet2, Bouabid Badaoui1, 2, Patrice Martin2 and Eric Chanat1.

1INRA, UR1196 Génomique et Physiologie de la Lactation, Domaine de Vilvert, F-78352 Jouy-en-Josas, France

2INRA, UMR1313, Génétique animale & Biologie intégrative, équipe « LGS-PiCTGem », Domaine de Vilvert, F-78352 Jouy-en-Josas, France

During lactation, mammary epithelial cells synthesize and secrete huge quantities of milk specific proteins, lipids and lactose. The biogenesis of milk supramolecular structures, casein micelles and milk fat globules, is initiated in the endoplasmic reticulum (ER) of mammary epithelial cells. These components then follow independent intracellular trafficking pathways and milk supramolecular structures are released into the alveolar lumens of the mammary gland.

Both proteins and lipids composition are dramatically affected in the milk of goat with defective alleles at the CSN1S1 (alpha S1-casein) locus. It has been demonstrated that the lack of CSN1S1 in goat homozygous for the null allele (O/O) induces the accumulation of the other caseins in the ER, a phenomenon which, in turn, causes an Unfolded Protein Response (UPR). In addition, the secretion of both milk proteins and lipids is affected. Links between these two secretory processes are therefore very likely.

To better understand the molecular mechanisms driving these two essential secretory functions, a differential proteomic analysis (2D-DIGE) of goats mammary microsomes of extreme CSN1S1 genotypes (A/A vs. O/O) was undertaken. Microsomal membrane proteins and proteins of the whole microsomes were analyzed by 16-BAC/SDS PAGE and IEF/SDS PAGE, respectively. Statistic analysis has revealed differential protein profiles between the two genotypes and the most significant spots were identified by LC-MS/MS. The biological relevance of these differences will be discussed.

This study will improve our knowledge about the molecular mechanisms involved in milk protein and lipid secretions and might allow us to understand how the mammary tissue adapts to long-term UPR.

This work was funded by the ANR (Genanimal program) and APIS Gene.

Keywords: AlphaS1-casein, Endoplasmic reticulum, Protein and lipid secretion, 2D DIGE, UPR.

Impacts de la prise en compte d'une étape de sélection assistée par marqueurs / sélection génomique dans les évaluations génétiques nationales et multinationales

Clotilde PATRY (clotilde.patry@jouy.inra.fr)

Unité GABI - Equipe Génétique et génomique bovines

Encadrant : Vincent Ducrocq

La sélection des bovins laitiers pour l'amélioration de caractères d'intérêts économiques dépend de l'estimation de la valeur génétique des reproducteurs. Classiquement, les performances propres, celles de la descendance et des apparentés sont enregistrées puis traitées par la méthode BLUP (Best linear unbiased predictor) (Henderson, 1975), modèle animal. Le modèle animal décrit les facteurs de variation des performances d'un animal, en distinguant sa valeur génétique transmissible des facteurs de milieu. Le BLUP corrige au mieux des effets du milieu et combine de façon optimale les performances et l'information généalogique. Avec le développement de la génomique, on pourrait aussi disposer d'une information de nature moléculaire, permettant alors d'introduire précocement dans les schémas de sélection des taureaux non testés sur descendance. Les caractéristiques de ces taureaux (moyenne et écart-type de leur aléa de méiose) pourraient perturber les hypothèses conduisant aux propriétés optimales du BLUP. La qualité des évaluations génétiques classiques pourrait être remise en cause et impacter les comparaisons entre reproducteurs à l'échelle nationale et internationale mais aussi la qualité des équations de prédiction pour l'évaluation génomique. Il s'agit donc dans un premier temps de mettre en évidence l'existence d'un biais entre les évaluations classiques et les évaluations ayant introduits des taureaux sur information génomique avant de développer une méthodologie pour réduire voire corriger ce biais. La méthode repose sur la simulation de valeurs génétiques vraies pour deux groupes de taureaux et leur descendance, un des deux groupes étant caractérisé par une supériorité génétique significative comparée au second groupe. Les valeurs génétiques vraies sont alors comparées aux valeurs génétiques estimées issues du processus d'évaluation génétique (BLUP). Ainsi, on présentera le principe de la méthode et les premiers résultats de caractérisation du biais.

Mots-clés : Sélection génétique et génomique - bovins laitiers - méthode du BLUP