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Dernière mise à jour : Mai 2018

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Microscopie à illumination structurée (Zeiss Apotome)

Ce microscope inversé permet l'observation de matériels fixés ou vivants. Dans sa configuration actuelle, l'utilisateur dispose d'une illumination de type Colibri constituée de LEDs permettant une excitation à 365 nm, 470 nm, 530 nm et 625 nm,  et de 4 jeux de filtres de fluorescence adaptés aux fluorophores de type DAPI, FITC, Rhodamine, et Cyanine 5. La numérisation des images est faite avec une caméra Axiocam MRm. Il est possible de travailler en mode Apotome (coupe optique) et non apotome (microscopie "conventionelle" de champ large).

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Le microscope à illumination structurée Zeiss Apotome utilise la méthode d’illumination structurée appelée 1D-SIM (SIM : « structured illumination microscopy »). Cette méthode de projection de grille permet de retirer le flou dans l’image à partir de seulement 3 images et d'obtenir ainsi des images confocales pour des échantillons dont l'épaisseur ne dépasse pas 30 microns.

La microscopie à illumination structurée a d’abord été appliquée à la microscopie conventionnelle, dite microscopie « champ large », et c’est cet aspect que nous aborderons ici. En microscopie conventionnelle, la résolution optique qui est la distance minimum entre deux points discernables, est calculée en général selon le critère de Rayleigh (r = 0.61 lambda/NA en microscopie de fluorescence) qui correspond en fait à un contraste de 26%. En réalité, l’optique présente une barrière de résolution infranchissable, celle pour laquelle le contraste est nul, et cette résolution limite dite « de coupure » se calcule ainsi :  rc = 0.5 lambda/NA (critère de Sparrow). Pour transformer notre microscope conventionnel en SIM, il faut introduire un motif structuré, connu, afin de générer des interférences dans le champ d’observation du microscope. L’image ainsi formée représente la modulation du signal d’intérêt, par exemple notre marquage fluorescent, par le motif structuré qui est lui-même un motif sinusoïdal. Un traitement mathématique des images est alors nécessaire pour retirer cette modulation, c'est-à-dire pour démoduler le signal d’intérêt et cela permet dans certaines conditions d’améliorer le contraste et par conséquent la résolution, et même de dépasser la résolution limite de coupure (super-resolution).

Le microscope à illumination structurée Zeiss Apotome utilise la méthode d’illumination structurée décrite en 1997 (Neil, Juskaitis & Wilson. Optics letters 1997, 22:1905-1907). Pour générer les interférences lumineuses dans le plan d’observation, on utilise une grille (1D) positionnée dans le trajet d’illumination (technique de projection de grille) et si elle est positionnée dans le plan conjugué, la modulation ne sera effective que pour l’image du plan focal et non pour le signal hors focus. En d’autres termes, la projection d’une grille dans le plan focal permet d’obtenir une image où la grille disparait avec la défocalisation. Cette propriété permet de retirer le flou dans l’image à partir de seulement 3 images qui doivent être acquises avec un déphasage du motif interférentiel d’un tiers de phase à chaque fois (0, 2pi/3 , 4pi/3). Il est ainsi possible de recalculer d’une part l’image conventionnelle qui est la somme des 3 images et d’autre part l’image du plan focal avec une résolution confocale par soustraction des images deux à deux. La fréquence de la grille doit être suffisamment élevée et elle dépend du grossissement et de l’ouverture numérique de l’objectif et de la longueur d’onde utilisée.