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Dernière mise à jour : Mai 2018

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Virologie et Immunologie Moléculaires

Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires

Etude in vitro

Travail sur la lignée de cellules épithéliales humaine A549

Étude des fonctions de PB1-F2 sur cellules épithéliales respiratoires humaine A549
Les résultats de ce travail ont été publiés en 2010 dans Journal of Immunology : J Immunol. 2010;185(8):4812-23.
Afin d’étudier la contribution de PB1-F2 dans la réponse innée des cellules épithéliales respiratoires qui constituent les principales cibles du virus influenza, nous avons entrepris de caractériser le transcriptome associé à l’expression de PB1-F2 au cours de l’infection virale. Pour ce faire, nous avons construit un mutant par génétique inverse (ΔF2, cf: production du virus ΔF2) incapable d’exprimer PB1-F2 pour comparer l’expression des gènes induits par le virus WSN et son mutant ΔF2 sur des lignées de cellules alvéolaires de poumon humain.
Nous avons identifié, sur un total de 41000 gènes analysés, 616 gènes dont l’expression diffère entre les cellules infectées par le virus parental ou son mutant. L’analyse ontologique des données obtenues a révélé que PB1-F2 est impliquée dans deux processus majeurs de l’immunité : l’inflammation et la présentation de l’antigène. L’expression de PB1-F2 exacerbe l’expression des gènes impliqués dans ces deux fonctions.

Cluster de gènes spécifiques de PB1-F2

A l’aide de l’application ‘Ingenuity’2, nous avons pu comparer la régulation des gènes spécifiquement induits ou réprimés par PB1-F2 et identifier les voies de signalisation engagées dans ces processus. Les voies de signalisation de type interféron apparaissent comme les éléments majeurs impliqués dans la régulation des gènes identifiés comme spécifiquement induits par PB1-F2. Nous avons vérifié par PCR quantitative les niveaux d’expression de l’interféron-ß (IFN-ß). L’analyse comparative des cinétiques de production d’IFN-ß dans les différentes conditions d’infection confirme que PB1-F2 exacerbe l’expression de cette cytokine.
Ces résultats placent donc PB1-F2 comme un élément antagoniste de la protéine NS1. En effet, la fonction principale de NS1 est d’inhiber la synthèse d’interférons afin d’empêcher la mise en place d’une défense antivirale efficace par la cellule hôte. Nous avons donc cherché à caractériser l’effet de PB1-F2 dans un système d’infection dépourvu de NS1 en employant des virus mutants ΔNS1 et doublement mutants ΔNS1-ΔF2. Il apparaît que le virus ΔNS1 induit beaucoup plus d’IFN-ß que le virus ΔNS1-ΔF2 (3300 vs 400 fois). Ces mesures confirment la contribution importante de PB1-F2 dans l’induction d’IFN-ß au cours de l’infection virale et placent NS1 et PB1-F2 dans des rôles antagonistes. L’effet inhibiteur de NS1 semble toutefois prendre le pas sur l’effet inducteur de PB1-F2. Enfin, afin de vérifier que la réponse de l’hôte à PB1-F2 ne soit pas spécifique au virus WSN/33, nous avons contrôlé l’activité de plusieurs PB1-F2 issues de souches différentes (H1N1, H3N2, H5N1 et H6N2) sur la production d’IFN-ß. Pour ce faire, des cellules ont été transfectées par des plasmides exprimant différents variants de PB1-F2 puis infectées ou non par un virus n’exprimant pas PB1-F2. Nos résultats montrent que dans les cellules infectées, l’induction d’un grand nombre de variants de PB1-F2, mais pas de l’ensemble des variants, exacerbe la production d’IFN-ß. En revanche, l’expression de PB1-F2 hors d’un contexte infectieux s’avère incapable d’exacerber la production d’IFN-ß. Ceci confirme donc que l’action de PB1-F2 n’est pas restreinte à un seul génotype de virus influenza. En résumé, PB1-F2 a un impact transcriptionnel sur la cellule hôte infectée qui est essentiellement axé sur la production d’IFN-ß. Ceci a pour conséquence une meilleure expression de gènes impliqués dans la présentation de l’antigène et pourrait s’inscrire dans une stratégie d’échappement du virus au système immunitaire. En effet, il a été démontré que des peptides issus de PB1-F2 sont présentés par le CMH-I mais que les lymphocytes CD8+ spécifiques de ces peptides sont très peu cytolitiques. PB1-F2 pourrait ainsi fonctionner comme un leurre du système immunitaire adaptatif antiviral.

Transcriptome PB1-F2
Visualisation du transcriptome spécifique de PB1-F2 au cours d'une infection virale.

Visualisation des transcriptomes IAV vs. IAVdeltaF2

L'ensemble des gènes exprimé par les cellules A549 est représenté : en ordonnée se trouvent les facteurs d'induction (en Log base 2) au cours d'une infection de 24h par le virus sauvage (WSN), et en abcisse les facteurs d'induction au cours d'une infection par le virus dépourvu de PB1-F2. Les facteurs d'induction sont calculés à par rapport aux cellules non infectées. Chaque spot correspond à aux niveaux d'expression d'un gène. Un spot qui s'éloigne de la médiane se comporte différemment entre les deux conditions expérimentales.

Voies de signalisation activées par PB1-F2
Comparaison des gènes induits au cours de l'infection par les virus sauvage et mutant.
Les gènes régulés au cours des différentes infections virales ont été regroupés dans un diagramme de Ven. 616 gènes ont leur régulation influencée par la présence de PB1-F2. Parmis ces 616 gènes, 508 sont régulés lorsque PB1-F2 est exprimée au cours de l'infection. Les fonctions associées à ces gènes sont :

  1. La présentation de l'antigène
  2. L'activation des IRF* par des PRR**
  3. La signalisation de type interféron
  4. L'ubiquitination
  5. L'immunité antivirale relayée par les Rig-like recepteurs.
Diagramme de Venn
 * IRF : Interferon regulating factor ** PRR : Pattern recognition receptor