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Principe de l’invention :

L’obtention de la protéine N recombinante se heurtait précédemment à des problèmes critiques de pureté et de solubilité. L’équipe de Jean-François Eléouët a résolu ces difficultés en développant et brevetant un procédé original de production et de purification de la protéine N basé sur la co-expression de cette protéine avec la protéine P tronquée du VRS, la protéine N étant par la suite aisément isolée de ces complexes solubles. La protéine N ainsi purifiée se présente sous forme d’anneaux d’environ 10 nm de diamètre contenant 10 molécules N et un ARN d’environ 70 bases.

Les structures en anneaux de protéine N obtenues ont démontré leurs propriétés immunogéniques et vaccinales dans le modèle de référence murin. L’administration par voie nasale de la protéine N, avec ou sans adjuvant dédié (lymphotoxine détoxifiée d’E. coli LT(R192G)), a induit une forte production d’anticorps sériques. De façon remarquable, la protéine N a stimulé la sécrétion d’IgA spécifiques dans la muqueuse respiratoire et cela même en l’absence d’adjuvant. L’immunité à médiation cellulaire (CD4, CD8) a été stimulée au niveau systémique et local par l’administration nasale des nano-anneaux de protéine N en présence d’adjuvant. Une baisse significative de la réplication virale associée à une inflammation modérée a été observée dans la sphère pulmonaire après une épreuve infectieuse des animaux vaccinés. L’évaluation des propriétés vaccinales des anneaux de protéine N a également été conduite dans le modèle expérimental bovin (espèce cible de la maladie), en animalerie de confinement A2. Le protocole vaccinal (primo-injection et rappel intra-musculaire) a induit une bonne réponse humorale (anticorps anti-N détectés dans le sérum et les sécrétions nasales) et cellulaire (dans les ganglions drainant le site de vaccination) et a permis de protéger partiellement les veaux vaccinés contre l’infection expérimentale par le VRS bovin (baisse de la charge virale et du score clinique), sans exacerbation de signes physiopathologiques.

Par ailleurs, l’équipe de Jean-François Eléouët a démontré que ces structures en anneaux de protéine N pouvaient être utilisées comme support pour y greffer des protéines hétérologues. Des complexes solubles protéine de fusion N-GFP (Green Fluorescent Protein) ont ainsi été produits et purifiés. Il est à noter que la présentation de la GFP dans le contexte de la protéine hétérologue N-GFP a induit dans le modèle murin une réponse humorale augmentée par rapport à l’utilisation vaccinale de la GFP seule. Il a été observé par microscopie confocale que ces protéines recombinantes étaient adsorbées et internalisées par différents types cellulaires ayant des implications potentielles dans les réponses immunitaires (monocytes, cellules dendritiques, cellules épithéliales), démontrant ainsi qu’il était possible d’adresser des molécules d’intérêt thérapeutique ou vaccinal au moyen de la protéine N du VRS. Cette stratégie pourra être appliquée au développement du vaccin contre le VRS en ajoutant sur les anneaux des déterminants antigéniques des protéines à la surface des particules virales et décrits comme cibles des anticorps neutralisants.

Applications industrielles :

Le procédé breveté de préparation de la protéine de nucléocapside N des virus appartenant à la famille des Paramyxoviridae permet le développement de nombreuses applications en santé humaine et dans le domaine vétérinaire :

• Vaccination contre les Paramyxoviridae, dont le VRS humain et bovin,
• Développement d’outils de diagnostic des infections par les Paramyxoviridae,
• Utilisation des anneaux de protéines N recombinantes comme vecteurs de molécules d’intérêt thérapeutique ou vaccinal.

Propriété intellectuelle et transfert technologique :

L’ensemble de ces résultats a été protégé par le dépôt de deux demandes de brevet internationales dont les numéros de publication sont WO2006/117456 et WO2007/119011 (déposant : INRA), et pour lesquelles INRA Transfert est en charge de la valorisation (licence, option de licence).

Publications :

• Tran TL, Castagné N, Bhella D, Varela PF, Bernard J, Chilmonczyk S, Berkenkamp S, Benhamo V, Grznarova K, Grosclaude J, Nespoulos C, Rey FA and Eléouët JF.
  The nine C-terminal amino acids of the respiratory syncytial virus protein P are necessary and sufficient for binding to ribonucleoprotein complexes in which six ribonucleotides are contacted per N protein protomer. Journal of General Virology (2007), 88, 196–206

• Roux X, Dubuquoy C, Durand G, Tran-Tolla TL, Castagné N, Bernard J, Petit-Camurdan A, Eléouët JF, Riffault S.
  Sub-Nucleocapsid Nanoparticles: A Nasal Vaccine against Respiratory Syncytial Virus. PLoS ONE 3(3): e1766